시퀀싱(Sequencing)

게노믹스의 진보

게노믹스의 발전으로 많은 기존 기술의 적용 범위가 유전자 스케일에서 게놈 스케일로 확장되었으며 동시에 비용도 감소했습니다.
DNA 시퀀싱 기술과 유전자 발현 측정 기술이 가장 큰 혜택을 누리고 있습니다. 게노믹스에는 구조적 측면과 기능적 측면이라는 두 가지 큰 측면이 있습니다.
구조 게놈은 게놈에 의해 암호화된 단백질의 3차원 (3D) 구조를 연구하려고 합니다. 따라서 구조 게노믹스 접근법은 단백질의 3D 구조를 예측하기 위해 실험 데이터 및 모델링 데이터와 통합되는 게놈 서열에 대한 지식이 필요합니다. 이름에서 알 수 있듯이 기능 유전체학은 유전자 (및 단백질)의 기능과 상호 작용을 연구하는 것을 목표로 합니다. 따라서 기능 유전체학은 전사, 번역, 단백질 상호작용 등의 과정에 초점을 맞춘다. 사실, 게노믹스의 구조적 측면과 기능적 측면에는 중복이 있습니다. 그것은 단순히 둘 다 게놈 서열에 대한 지식이 필요하기 때문입니다.
게노믹스의 진보에 따라 클로닝, 핵산 증폭, 시퀀싱, 돌연변이유발, 돌연변이 검출, 유전자와 단백질의 상호작용, 발현 연구 등의 전통적인 분자 생물학 기술은 효율, 비용, 높은 처리량의 점에서 크게 향상되었습니다. 자연. 이러한 기술 중에서 DNA 시퀀싱 기술과 유전자 발현 기술이 가장 혁신되고 있으며, 이러한 기술의 적용 범위는 유전자 스케일에서 게놈 스케일로 향상되었습니다.

Sanger 시퀀스에서 파이로 시퀀스로의 전환

게놈 시퀀싱은 단일 염기 다형성 (SNP) 및 복사 수 다형성 (CNV)와 같은 돌연변이를 검출하는 가장 직접적인 방법입니다. DNA 시퀀싱의 디데옥시 방법의 개발은 분자 생물학의 과학에 큰 전진이었습니다. DNA 시퀀싱의 디데옥시 방법은 1977년에 Sanger 등에 의해 발표되었습니다.
이 기술은 사슬 정지(chain-termination) 원리를 기반으로 합니다. 즉, DNA 중합효소가 DNA 가닥을 연장할 때, 디데옥시뉴클레오티드의 흡수에 의해 추가적인 가닥 연장이 중단됩니다. Sanger의 디데옥시 시퀀싱 개발 후 약 20년 후 파르나이렌은 파이로 시퀀싱 기술을 도입했습니다. 파이로 시퀀싱 기술은 일반적으로 차세대 시퀀싱 또는 차세대 시퀀싱 (NGS) 기술이라고 불리는 대규모 고 처리량 초 병렬 시퀀싱 기술의 개발과 상업화에 대한 길을 열었습니다.

DNA 퀀싱

파이로 시퀀스, 돌연변이 검출 및 SNP genotypeping

파이로 시퀀스는 합성에 의한 시퀀스의 원리에 기초합니다. DNA 중합 효소가 DNA 가닥을 늘리면 피로 포스페이트가 방출됩니다. 방출된 각 피로인산은 검출가능한 양의 빛을 생성하는 일련의 반응을 일으키고 파이로 시퀀스는 유전자 서열의 실시간 검출을 가능하게 합니다. 따라서 이 기술은 서열 내 점 돌연변이의 신속한 검출과 미생물의 유전형 분석을 포함한 SNP 유전형 분석에 유용합니다. 시퀀싱이 필요한 DNA 템플릿은 먼저 폴리 머라지 연쇄 반응 (PCR)에 의해 증폭됩니다. 앰플리콘 (이중 가닥 증폭 단편)의 길이는 효율적인 파이로 시퀀싱을 위해 일반적으로 200bp 미만이지만 그보다 길어질 수 있습니다. 일반 PCR의 사이클 수는 약 30이지만 파이로 시퀀싱 PCR의 사이클 수는 약 50입니다. 이는 프라이머와 유리 뉴클레오티드를 가능한 한 많이 활용하기 때문입니다. 두 PCR 프라이머 중 하나는 5'-말단 바이오틴화 되었습니다. 바이오틴화 말단을 포함하는 PCR 앰플리콘은 스트렙타비딘으로 코팅된 세파로스 비드 상에 포획되고, 알칼리로 변성되고, 파이로 시퀀스 전에 정제된다. 바이오틴화된 사슬은 파이로 시퀀스의 템플릿으로 사용됩니다. 정제된 바이오틴 화 PCR 가닥에 파이로 시퀀스 프라이머 (제3 프라이머)가 추가되고 파이로 시퀀스가 수행됩니다.
파이로 시퀀스는 96-well plate에서 이루어집니다. 이 과정에서 먼저 4 개의 효소 (DNA polymerase, ATP sulfurylase, luciferase, apyrase)와 2 개의 기질 (denosine 5'-phosphosulfate (APS) and luciferin)의 존재하에 시퀀싱 프라이머를 DNA 템플릿과 어닐링 합니다. 데옥시뉴클레오티드 트리포스페이트 (dNTP).
그런 다음 개별 dNTP가 실행되기 전에 프로그래밍된 고정 순서로 반응에 순차적으로 추가됩니다. 4 개의 dNTP 중 dATP 만이 deoxiadenosine alpha-thiotriphosphate (dATPαS)로 대체됩니다. 추가된 dNTP가 주형 사슬의 염기에 상보 적이면 DNA 중합 효소에 의해 캡처되어 피로 포스페이트 (PPi)가 방출됩니다. ATP 설프릴라제는 이 PPI와 APS를 이용하여 ATP를 생성합니다. ATP는 루시퍼 라제에 의해 사용되며 루시페린을 옥시 루시 페린으로 산화시키고 동시에 빛이 방출되고 전하 결합 소자 (CCD) 카메라에 의해 피크 형태로 기록됩니다. 반응의 화학양론으로 피크의 높이는 직접 비례합니다.
Apilase 반응은 배경 잡음 수준을 낮게 유지하는 데 매우 중요합니다. 파이로 시퀀스의 읽기를 파이로그램이라고 합니다. 쿼리 DNA (샘플) 파이로그램과 야생형 DNA (참조) 파이로그램을 비교하여 SNP를 감지할 수 있습니다. 이 알고리즘에는 유의성을 조사하기 위한 통계 분석이 포함됩니다.

 

차세대 시퀀스 플랫폼

차세대 시퀀스(NGS)는 높은 처리량의 초병렬 시퀀스입니다. NGS는 2세대 시퀀스 기술이라고도 합니다(1세대는 Sanger, Maxam, Gilbert의 원래 시퀀스 기술입니다). 최초의 인간 게놈 해독에 드는 비용은 30억 달러로 추정되고 있었습니다. J. Craig Venter 박사의 게놈 해독에는 1억 달러가 들었다고 전해지고 있습니다만, James Watson 박사의 게놈 해독에는 100만 달러 미만의 비용이 들었습니다. 자동화, 높은 처리량 및 비용 절감의 관점에서 시퀀스 기술을 강화합니다. 궁극적인 꿈은 시퀀싱 비용을 게놈당 1000달러까지 낮추어 개인화 의학과 개별화 영양을 목적으로 개인의 게놈을 분석할 수 있도록 하는 것입니다. DNA (시퀀싱) 라이브러리 준비, 고체 지지체에 라이브러리 단편 고정, 단편 증폭, 단편 초 병렬 시퀀싱 및 배열의 컴퓨터 지원 어셈블리. 이 과정에서 통합된 각 뉴클레오타이드 염기는 "워시 샌드 스캔"법에 의해 검출됩니다. 대규모 병렬 시퀀스를 실현하기 위해 실행 당 수백만 개의 반응이 이미징 됩니다. 각 읽기 길이는 짧습니다. NGS 플랫폼에서 사용하는 DNA 시퀀스 라이브러리는 표면에 고정된 단일 가닥 조각 모음입니다. 시퀀스 라이브러리의 준비는 중요한 단계입니다. 따라서 NGS 기술은 시퀀싱을 위해 DNA 단편을 복제할 필요가 없습니다. 아래에서 설명하는 세 가지 인기 있는 NGS 플랫폼은 Roche 454, Illumina Solexa 및 ABI SOLiD입니다. 이 모든 기술은 단편을 복제하지 않고 개별 단편의 배열을 직접 읽습니다.